其他项目检验

1  主题内容与适用范围

本标准规定了种子生活力的生化(四唑)测定、种子健康测定、种子重量测定和包衣种子质量检验方法。

本标准适用于农作物种子质量的检测。

2  引用标准

    GB/T 3543.2  农作物种子检验规程  扦样

    GB/T 3543.3  农作物种子检验规程  净度分析

    GB/T 3543.4  农作物种子检验规程  发芽试验

3  术语

3.1  种子生活力  seed viability

    种子发芽的潜在能力或种胚具有的生命力。

3.2  种子健康状况  seed health

    种子是否携带病原菌(如真菌、细菌及病毒)、有害动物(如线虫及害虫)。

3.3  培养  incubation

    将种子保持在有利于病原体发育或病症发展的环境下进行培养。

3.4  千粒重  the weight of 1000 seeds

    国家种子质量标准规定水分的1000粒种子的重量，以克为单位。

3.5  丸化种子  seed pellets

    为精量播种，整批种子通常做成在大小和形状上没有明显差异的单粒球状种子单位。丸化种子添加的丸粒物质可能含有杀虫剂、染料或其他添加剂。

3.6  包膜种子  encrusted seed

    种子形状类似于原来的种子单位，其大小和重量变化范围可大可小。包衣物质可能含有杀虫剂、杀菌剂、染料或其他添加剂。

3.7  种子毯  seed mats

    种子随机成条状，簇状或散布在整片用宽而薄的毯状材料(如纸或其他低级材料制成)上。

3.8  种子带  seed tapes

    种子随机成簇状或单行排列在狭带的材料(如纸或其他低级材料制成)上。

3.9  处理种子  treated seed

    种子用杀虫剂、染料或其他添加剂处理，不引起其大小和形状的显著变化或增加原来的重量。处理种子仍可按GB/T 3543.1-3543.6 的规定方法进行测定。  

第一篇      生活力的生化(四唑)测定  

4  试剂

应用四唑的0.1%-1.0%(m/V)溶液，1.0%溶液用于不切开胚的种子染色，而0.1%-0.5%溶液可用于已经切开胚的种子染色。配成的溶液须贮存在黑暗处或棕色瓶里。

如果用蒸馏水配制溶液的pH值不在6.5-7.5范围内，则采用磷酸缓冲液来配制。

磷酸缓冲液的配制方法如下：

溶液I：称取9.078g磷酸二氢钾(KH2PO4)溶解于1000mL蒸馏水中。

溶液II：称取9.472g磷酸氢二钠(Na2HPO4)或11.876g磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)溶解于1000mL的蒸馏水中。

取溶液Ⅰ2份和溶液Ⅱ3份混合即成缓冲液。

在该缓冲液中溶解准确数量的四唑盐类，以获得准确的浓度。如每100mL缓冲液中溶入1g四唑盐类即得1%浓度的溶液。

5  仪器、设备

5.1  控温设备

    a.电热恒温箱或发芽箱；

    b.冰箱。

5.2  观察器具

    a.体视显微镜或手持放大镜；

    b.光线充足柔和的灯光。

5.3  容器

    a.棕色定量加液器；

    b.不同规格的染色盘。

5.4  切刺工具

    单面刀片、矛状解剖针、小针等。

5.5  预湿物品

    滤纸、吸水纸和毛巾等。

5.6  天平

    天平感量为0.001g。

5.7  其他

    镊子、吸管等。

6  测定程序

6.1  试验样品的数取

每次至少测定200粒种子，从经净度分析后并充分混合的净种子中，随机数取每重量100粒或少于100粒的若于副重复。如是测定发芽末期休眠种子的生活力，则单用试验末期的休眠种子。

6.2  种子的预措预湿

预措是指有些种子在预湿前须先除去种子的外部附属物(包括剥去果壳)和在种子非 要害部位弄破种皮，如水稻种子脱去内外稃，刺破硬实等。

为加快充分吸湿、软化种皮，便于样品准备，以提高染色的均匀度，通常种子在染色前要进行预湿。根据种的不同，预湿的方法有所不同。一种是缓慢润湿，即将种子放在纸上或纸间吸湿，它适用于直接浸在水中容易破裂种子(如豆科大粒种子)，以及许多陈种子和过分干燥种子；另一种是水中浸渍，即将种子完全浸在水中，让其达到充分吸胀，它适用于直接浸入水中而不会造成组织破裂损伤的种子。不同种类种子的具体预湿温度和时间可参见表1。

表（一）

6.3  染色前的准备

为了使胚的主要构造和活的营养组织暴露出来，便于四唑溶液快速而充分地渗入和观察鉴定，经软化的种子应进行样品准备。准备方法因种子构造和胚的位置不同而异(详见表1)，如禾谷类种子沿胚纵切，伞形科种子近胚纵切，葱属沿种子扁平面纵切等。西瓜等种子预湿后表面有粘液，可采用种子表面干燥或把种子夹在布或纸间揩擦清除掉。

6.4  染色

将已准备好的种子样品放入染色盘中，加入适宜浓度的四唑溶液(表1)以完全淹没种子，移置一定温度的黑暗控温设备内或弱光下进行染色反应。所用染色时间因四唑溶液度、温度、种子种类、样品准备方法等因素的不同而有差异。一般来说，四唑溶液浓度高，染色快；温度高，染色时间短，但最高不超过45℃。到达规定时间或染色已很明显时，倒去四唑溶液，用清水冲洗。

6.5  鉴定前处理

为便于观察鉴定和计数，将已染色的种子样品，加以适当处理使胚主要构造和活的营养组织明显暴露出来，如一些豆类沿胚中轴纵切，瓜类剥去种皮和内膜等。不同种类种子的处理方法详见表1。

6.6 观察鉴定

大中粒种子可直接用肉眼或手持放大镜进行观察鉴定，对小粒种子最好用10-100倍体视显微镜进行观察。

观察鉴定时，确定种子是否具有生活力，必须根据胚的主要构造和有关活营养组织的染色情况进行正确的判断。一般的鉴定原则是：凡胚的主要构造或有关活营养组织(如葱属、伞形科和茄科等种子的胚乳)全部染成有光泽的鲜红色或染色最大面积大于表1规定，且组织状态正常的为正常有生活力的种子；否则为无生活力的种子。根据种类的不同，具体鉴定标准详见表1。

依据鉴定标准，将各部分分开和计数。

7  结果表示与报告

计算各个重复中有生活力的种子数，重复间最大容许差距不得超过表2的规定，平均百分率计算到最近似的整数。

表2  生活力测定重复间的最大容许差距

    在GB/T 3543.1的结果报告单“其他测定项目”栏中要填报“四唑测定有生活力的种子—%”。

    对豆类、棉籽和蕹菜等需增填“试验中发现的硬实百分率”，硬实百分率应包括在所填报有生活力种子的百分率中。

第二篇  种子健康测定

8  仪器设备

    a.显微镜(60倍双目显微镜)；

    b.培养箱；

    c.近紫外灯；

    d.冷冻冰箱；

    e.高压消毒锅、培养皿等。

9  测定程序

9.1  未经培养的检验(不能说明病原菌的生活力)

    a.直接检查

适用于较大的病原体或杂质外表有明显症状的病害，如麦角、线虫瘿、虫瘿、黑穗病孢子、螨类等。必要时，可应用双目显微镜对试样进行检查，取出病原体或病粒，称其重量或计算其粒数。

    b.吸胀种子检查

为使子实体、病症或害虫更容易观察到或促进孢子释放，把试验样品浸入水中或其他液体中，种子吸胀后检查其表面或内部，最好用双目显微镜。

    c.洗涤检查

用于检查附着在种子表面的病菌孢子或颖壳上的病原线虫。

分取样品两份，每份5g，分别倒入100mL三角瓶内，加无菌水10mL，如使病原体洗涤更彻底，可加入0.1%润滑剂(如磺化二羧酸酯)，置振荡机上振荡，光滑种子振荡5min，粗糙种子振荡10min。将洗涤液移入离心管内，在1000-1500×g离心3-5min。用吸管吸去上清液，留1mL的沉淀部分，稍加振荡。用干净的细玻璃棒将悬浮液分别滴于5片载玻片上。盖上盖玻片，用400-500倍的显微镜检查，每片检查10个视野，并计算每视野平均孢子数，据此可计算病菌孢子负荷量，按式(1)计算：

               N=n1×n2×n3/n4                                        （1）

式中：

N—每克种子的孢子负荷量；

n1—每视野平均孢子数；

n2—盖玻片面积上的视野数；

n3—1mL水的滴数；

n4—供试样品的重量。

    d.剖粒检查

取试样5-10g(小麦等中粒种子5g，玉米、豌豆大粒种子10g)用刀剖开或切开种子的被害或可疑部分，检查害虫。

    e.染色检查

高锰酸钾染色法：适用于检查隐蔽的米象、谷象。取试样15g，除去杂质，倒入铜丝网中，于30℃水中浸泡1min，再移入1%高锰酸钾溶液中染色1min。然后用清水洗涤，倒在白色吸水纸上用放大镜检查，挑出粒面上带有直径0.5mm的斑点即为害虫籽粒。计算害虫含量。

碘或碘化钾染色法：适用于检验豌豆象。取试样50g，除去杂质，放入铜丝网中或用纱布包好，浸入1%碘化钾或2%碘酒溶液中1-1.5min。取出放入0.5%的氢氧化钠溶液中，浸30s，取出用清水洗涤15-20s，立即检验，如豆粒表面有1-2mm直径的圆斑点，即为豆象感染。计算害虫含量。

    f.比重检验法

取试样100g，除去杂质，倒入食盐饱和溶液中(含盐35.9g溶于1000mL水中)，搅拌10-15min，静止1-2min，将悬浮在上层的种子取出，结合剖粒检验(见9.1d.)，计算害虫含量。

    g.软X射线检验

用于检查种子内隐匿的虫害(如蚕豆象、玉米象、麦蛾等)，通过照片或直接从荧光屏上观察。

9.2  培养后的检查

试验样品经过一定时间培养后，检查种子内外部和幼苗上是否存在病原菌或其症状。常用的培养基有三类：

    a.吸水纸法

吸水纸法适用于许多类型种子的种传真菌病害的检验，尤其是对于许多半知菌，有利于分生孢子的形成和致病真菌在幼苗上的症状的发展。

稻瘟病(Pyriculana oryzae Cav.)

取试样400粒种子，将培养皿内的吸水纸用水湿润，每个培养皿播25粒种子，在22℃下用12h黑暗和12h近紫外光照的交替周期培养7d。在12-50倍放大镜下检查每粒种子上的稻瘟病分生孢子。一般这种真菌会在颖片上产生小而不明显、灰色至绿色的分生孢子，这种分生孢子成束地着生在短而纤细的分生孢子梗的顶端。菌丝很少覆盖整粒种子。如有怀疑，可在200倍显微镜下检查分生孢子来核实。典型的分生孢子是倒梨形，透明，基部钝圆具有短齿，分两隔，通常具有尖锐的顶端，大小为(20-25)μm×(9-12)μm。

水稻胡麻叶斑病(Drechslera oryzae Subram & Jain)

取试样400粒种子，将培养皿里的吸水纸用水湿润，每个培养皿播25粒种子。在22℃下用12h黑暗和12h近紫外光照的交替周期培养7d。在12-50倍放大镜下检查每粒子上的胡麻叶斑病的分生孢子。在种皮上形成分生孢子梗和淡灰色气生菌丝，有时病菌会蔓延吸水纸上。如有怀疑可在200倍显微镜下检查分生孢子来核实。其分生孢子为月牙形，(35-170)μ×(11-17)μm，淡棕色至棕色，中部或近中部最宽，两端渐渐变细变圆。

十字花科的黑胫病(Leptosphaeria maculans Ces. & de Not.)即甘蓝黑腐病(Phoma lingam Desm.)

取试样1000粒种子，每个培养皿垫入三层滤纸，加入5mL0.2%(m/V)的2，4-二氯苯氧基乙酸钠盐(2，4-D)溶液，以抑制种子发芽。沥去多余的2，4-D溶液，用无菌水洗涤种子后，每个培养皿播0粒种子。在20℃用12h光照和12h黑暗交替周期下培养11d。经6d后，在25倍放大镜下，检查长在种子和培养基上的甘蓝黑腐病松散生长的银白色菌丝和分生孢子器原基。经11d后，进行第二次检查感染种子及期周围的分子孢子器。记录已长有的甘蓝黑腐病分生孢子器的感染种子。

    b.砂床法

适用于某些病原体的检验。用砂时应去掉砂中杂质并通过1mm孔径的筛子，将砂粒清洗，高温烘干消毒后，放入培养皿内加水湿润，种子排列在砂床内，然后密闭保持高温，培养温度与纸床相同，待幼苗顶到培养皿盖时进行检查(约经7～10d)。

    c.琼脂皿法

主要用于发育较慢的致病真菌潜伏在种子内部的病原，也可用于检验种子外表的病原菌。

小麦颖枯病(Septoria nodorum Berk.)

先数取试样400粒，经1%(m/m)的次 氯酸钠消毒10min后，用无菌水洗 涤。在含0.01%硫酸链霉素的麦芽或马铃薯左旋糖琼脂的培养基上，每个培养皿播10粒种子于琼脂表面，在20℃黑暗条件下培养7d。用肉眼检查每粒种子上缓慢长成圆形菌落的情况，该病菌菌丝体为白色或乳白色，通常稠密地覆盖着感染的种子。菌落的背面呈黄色或褐色，并随其生长颜色变深。

豌豆褐斑病(Ascochyta pisi Lib)

先数取试样400粒，经1%(m/m)的次氯酸钠消毒10min后，用无菌水洗涤。在麦芽或马铃薯葡萄糖琼脂的培养基上，每个培养皿播10粒种子于琼脂表面，在20℃黑暗条件下培养7d。用肉眼检查每粒种子外部盖满的大量白色菌丝体。对有怀疑的菌落可放在25倍放大镜下观察，根据菌落边缘的波状菌丝来确定。

9.3  其他方法

大麦的散黑穗病菌可用整胚检验。

大麦散黑穗病(Ustilago nuda Rostr.)

两次重复，每次重复试验样品为100-120g(根据千粒重推算含有2000-4000粒种子)。先将试验样品放入1L新配制的5%(V/V)NaOH溶液中，在20℃下保持24h。用温水洗涤，使胚从软化的果皮里分离出来。收集胚在1mm网孔的筛子里，再用网也较大的筛子收集胚乳和稃壳。将胚放入乳酸苯酚(甘油、苯酚和乳酸各三分之一)和水的等量混合液里，使胚和稃壳能进一步分离。将胚移置盛有75mL清水的烧杯中，并在通风柜里，保持在沸点大约30s，以除去乳酸苯酚，并将其洗净。然后将胚移到新配制的微温甘油中，再放在16-25倍放大镜下，配置适当的台下灯光，检查大麦散黑穗病所特有的金褐色菌丝体，每次重复检查1000个胚。

测定样品中是否存在细菌、真菌或病毒等，可用生长植株进行检查，可在供检的样品中取出种子进行播种，或从样品中取得接种体，以供对健康幼苗或植株一部分进行感染试验。应注意植株从其他途径传播感染，并控制各种条件。

10  结果表示与报告

以供检的样品重量中感染种子数的百分率或病原体数目来表示结果。

填报结果要填报病原菌的学名，同时说明所用的测定方法，包括所用的预措方法，并说明用于检查的样品部分样品的数量。

第三篇  重量测定

11  仪器设备

    a.数粒仪或供发芽试验用的数种设备。

    b.感量为0.1，0.01g的天平。

12.2  测定方法

    任选下列方法之一进行测定。

    a.百粒法

    用手或数种器从试验样品中随机数取8个重复，每个重复100粒，分别称重(g)，小数位数与GB/T 3543.3的规定相同。

计算8个重复的平均重量、标准差及变异系数，按式(2)、(3)计算：

  标准差（S）＝ （2）