杂交玉米种子纯度快速鉴定技术及应用前景

辛景树　赵建宗

(全国农业技术推广服务中心)

纯度是衡量种子质量最重要的指标之一。GB/T3543.1～7－1995《农作物种子检验规程》中，玉米种子的发芽率、净度、水分等3项指标均可以在室内检验，速度较快，时间较短。而关于品种纯度的籽粒形态鉴定、幼苗鉴定和田间小区种植鉴定等3种方法，均存在一定缺陷。为科学、快速、准确鉴定玉米种子质量，1998年开始组织玉米种子检测技术的攻关研究，取得了可喜的成果。

1　研究内容和结果分析

1.1　开展对比研究，筛选目标方法

本研究的技术路线是从筛选方法入手，逐步完善技术，开展相关性研究，建立回归方程，创建标准图谱库，标准制订，推广应用，控制提高玉米种子质量。选择具有一定技术基础的对盐溶蛋白电泳、醋酸尿素蛋白电泳和酯酶同工酶电泳3种方法进行比较研究。为了达到对上述3种方法比较的目的，从全国抽取农大108等12个玉米品种组合36份种子样品，分发给12个实验室，按照统一的程序和方法进行试验，分别从电泳时间、操作难易、电泳图谱特征、电泳结果的重演性以及方法对参试品种的适用性等方面对3种电泳技术进行综合评价。

重演性分析

通过试验统计，盐溶蛋白质电泳方法标准差的平均值为2.18，醋酸尿素蛋白电泳方法标准差的平均值为2.59，酯酶同工酶电泳方法标准差的平均值为3.57。表明盐溶蛋白质电泳方法纯度鉴定值在12个实验室数据离散程度最小，精确度高，说明该方法在不同实验室有较高的重演性。

适用性分析

在12个试验室中，全部可用盐溶蛋白电泳鉴定方法检测12个品种的品种纯度，10个实验室可用醋酸尿素蛋白电泳方法检测12个品种的品种纯度，8个实验室可用酯酶同工酶电泳方法检测12个品种的品种纯度，说明盐溶蛋白电泳方法较其它两种方法有较好的适用性。

可操作性分析

盐溶蛋白电泳方法的样品提取时间和电泳时间短，电泳谱带清晰，分辨率高，品种间谱带差异大，组合间互补带明显，但试剂配制比较复杂，染色时间较长；醋酸尿素蛋白电泳方法试剂配制简便，单槽点样数多，样品提取时间和电泳时间短，电泳谱带复杂，谱带弯曲，界限不清晰；酯酶同工酶电泳方法单槽点样数多，谱带染色速度快，但试剂配制繁琐，样品提取时间和电泳时间较长，电泳谱带数量太少，分辨率低，品种间谱带差异小。3种方法都有缺陷，但盐溶蛋白电泳鉴定方法较其它两种方法有较强的可操作性。经济性分析　通过对3种方法所用仪器设备一次投资、每检测一个样品的费用支出进行比较，3种方法所用的仪器设备一次投资基本相同(1万元左右)，检验费用盐溶蛋白电泳方法和醋酸尿素蛋白电泳方法较低，酯酶同工酶电泳方法较高。

1.2　开展实用性研究，改进盐溶蛋白电泳方法

为使盐溶蛋白电泳方法更加有效地在各级种子生产、经营和管理部门推广应用，对电泳技术进行了以下几个方面的研究、改进和完善。改进试剂配制方法、简化操作程序　该项技术实验操作中所用的凝胶贮备液较多，每次制胶都需用多种贮备液混合配制，操作比较繁琐。根据各种试剂的性质和作用，在保证各成分浓度不变的情况下，将原来的A、B、C三种溶液分别配制，改为直接配制一种分离胶溶液；将D、E、F三种溶液分别配制，改为直接配成一种浓缩胶溶液。该配制方法经12个项目单位及10个试点企业试验验证，表明不仅简化了操作程序，而且保持了原有方法电泳谱带清晰、结果准确的特点。确定最佳样品提取时间　原方法中，样品提取时间规定为0.5h以上，没有确定提取时间的上限。我们在研究中发现，提取时间太长，电泳谱带容易丢失，鉴定结果容易出现误差。为此，我们采用同一份农大108玉米种子样品，对不同提取时间的电泳谱带效果进行试验，结果表明样品提取时间太短或太长都会造成谱带缺失或不清，提取时间以0.5～4h为宜。改变染色液浓度、缩短染色时间　在原方法中，染色液浓度较低，凝胶染色一般需10h以上才能用于鉴定。为了缩短染色时间，由农业部全国农作物种子质量监督检验测试中心采用不同浓度的染色液，在不同温度条件下进行染色试验，表明染色速度随染色液浓度增加而加快，但浓度在0.15%时胶板底色过深；染色速度随温度升高而加快，在35℃时电泳谱带清晰度明显降低。0.01%的考马斯亮兰染色液的染色效果以20℃、10～12h，25℃、10～12h，30℃、8h最好；采用0.05%的考马斯亮兰染色液的染色效果以20℃、10～12h，25℃、8～10h，30℃、6～8h最好；采用0.1%的考马斯亮兰染色液染色效果以20℃、8～10h，25℃、4～8h，30℃、2～6h最好；采用0.15%的考马斯亮兰染色液染色效果在20℃、2h，25℃、2h较好。进一步在30℃下对0.1%考马斯亮兰染色液染色1～2h观察(间隔5min)，发现110min染色时效果即可达到清晰。在保证谱带清晰度的前提下，项目组确定了染色条件为30℃、0.1%的考马斯亮兰染色液，染色时间为2h，使样品测定当天即可得出结果，大大加快了检验速度。根据以上试验，改进了试剂配制方法，将样品提取时间确定为0.5～4h，染色条件确定为用30℃、0.1%的考马斯亮兰染色液染色为2h，使盐溶蛋白电泳方法更易于操作。

1.3　研究盐溶蛋白电泳与田间种植鉴定结果的相关性，确立回归方程

用电泳检测结果推算品种纯度，使其运用于玉米种子纯度鉴定的实践，需要开展对比实验，确定盐溶蛋白质电泳和田间种植鉴定两种方法鉴定结果的相关性。在全国范围内统一征集有代表性的杂交玉米种子样品108份，涉及11个省(区、市)的82个品种。将每份样品平均分成两份。一份分发到项目单位进行蛋白质凝胶电泳鉴定，另一份统一进行田间小区纯度鉴定。室内电泳检测　采用同一种型号的电泳设备，使用相同的试剂盒，在相同的实验条件下进行盐溶蛋白电泳方法试验，用同样的标准对试验结果进行判定。在电泳纯度鉴定前，首先对各自收集品种的杂种与双亲在电泳图谱上的差异进行测定，并制作出待测品种的标准图谱。每品种取200粒种子样品进行电泳，对照该品种的标准图谱对电泳结果进行分析并计算出样品的电泳纯度值。项目共测试108份样品，其中可鉴定样品87份，占80.6%，不能鉴定样品21份，占19.4%；涉及82个品种，其中能鉴定品种67份，占81.7%，不能鉴定品种15份，占18.3%。田间小区种植鉴定　为减少试验误差，将田间小区种植鉴定试验统一安排到吉林农业大学试验站。试验按照GB/T3543.5－1995《农作物种子检验规程　真实性与品种纯度鉴定》的要求，为充分满足试验要求，每份样品设两个重复，每个重复单粒点播400粒，同时在行首种植其父母本各12粒，作为纯度鉴定时的对照样品。在盛花期进行了田间小区现场鉴定将室内检测值与田间鉴定值进行对比，得到可用盐溶蛋白电泳方法鉴定样品的室内测定与田间鉴定相对应的数值87组，通过相关性分析，室内检测与田间鉴定值之间呈正相关(相关系数r＝0.634)，置信度达到统计上的极显著水平(自由度n＝90，1%显著水平r＝0.267)。对87组数据进行回归分析，得出回归方程为Y＝52.93316+0.46116x，其中Y为田间小区种植鉴定纯度值，x为电泳纯度值。

1.4      创建杂交玉米主要品种图谱库，为推广应用提供标尺

品种的标准电泳图谱是进行电泳结果分析，进而计算出品种纯度的重要依据，在盐溶蛋白电泳方法鉴定杂交玉米种子纯度时对照标准图谱，通过回归方程即可计算出种子的品种纯度。统一样品　为了保证标准图谱准确、可靠、直观和实用，项目组收集了通过审定的180个玉米品种，包括杂交种种子180份，亲本种子360份，分发给12个项目单位。各项目单位选择籽粒颜色、形状、大小均匀一致的种子进行实验。规范方法　根据盐溶蛋白电泳方法的技术特点，各项目单位统一操作程序，统一仪器型号，统一采用由吉林省农作物种子质量监督检验站提供的试剂盒，将每个品种杂交种子10粒、父母本种子各5粒在一块凝胶板上进行电泳试验。筛选品种　为了筛选出盐溶蛋白质电泳方法能鉴定的品种，按上述统一的方法分别对180个品种进行电泳试验。根据11个项目单位的试验结果分析，180个品种中有137个电泳图谱具有清晰的双亲共显性互补带，可制作成标准图谱，占供试品种的76%。另有43个品种不能制作盐溶蛋白电泳图谱，占供试品种的24%。统一制作标准图谱　为了使标准图谱更加准确一致，减少实验误差，项目组将筛选出的137个品种的种子样品集中安排到一个实验室统一制作标准图谱。按上述规范的实验方法，进一步筛选种子，确定标准样品。每个品种进行4次电泳，制成548块凝胶板。从中选出清晰度高，结果一致的凝胶板照相制成137个玉米品种的标准图谱，编辑出版了《杂交玉米品种蛋白电泳图谱》一书。

2　应用前景与展望

2.1      补充检验规程，完善标准体系

本项目完成了鉴定玉米种子纯度电泳方法筛选及深入研究、电泳测定值与田间小区种植鉴定纯度值相关性分析、全国主推玉米杂交组合标准电泳图谱库的创建等三项工作，形成了准确、快速、低费和易推广的杂交玉米组合纯度盐溶蛋白电泳方法鉴定技术，作为农业行业标准已于2001年8月由农业部颁布实施，成为农作物种子检验规程的补充，完善了种子检验标准体系。

2.2　提供质量依据，净化种子市场

《种子法》实施后，种子质量管理进一步加强，在种子执法及质量纠纷处理过程中，该项技术可以及时、准确判定种子质量状况，为种子质量管理提供技术保障，对净化种子市场将起到很重要的作用。随着种子市场的发展和WTO的加入，种子质量必将成为企业占领市场的前提之一。该技术的应用缩短了种子检验时间，及时确定种子质量，防止不合格种子下地，对保护农民利益、农业生产安全，促进农业生产发展和农村社会稳定将起到积极作用。如将该技术推广到种子企业，不仅可以提供准确快速的纯度值，保证种子标签的真实性，而且可以及时了解种子质量状况，避免假劣种子流入市场，同时还可作为质量保证体系的重要组成部分，促使全面提高种子质量，增强市场竞争力。

2.3   建立新品种图谱索引，有效保护品种产权

随着《植物新品种保护条例》的实施，农作物新品种的保护有了法律依据。在新品种保护受理时，可利用该技术辅助进行DUS测定，作为新品种保护的依据；同时，利用该技术制作玉米新品种电泳标准图谱库，在计算机中建立索引，可在品种产权纠纷中判定争议品种的新颖性，进而保护品种产权。

3  问题及讨论

通过实验，在所征集到的180个杂交玉米品种中有137个品种电泳图谱具有清晰的双亲共显性互补带，可制作成标准图谱，另有43个品种不能制作盐溶蛋白电泳图谱。其主要原因有以下两点：一是盐溶蛋白电泳方法是通过不同品种在蛋白谱带的差异来鉴别品种的，而蛋白的表达则是由基因控制的。由于我国玉米品种遗传基础狭窄，部分亲本基因型相近或相同，反映到蛋白表达上差异不明显，很难通过蛋白电泳方法进行鉴别；二是有些亲本主要是在已有杂交种基础上选育出来的多环系，遗传基础复杂，在自交后代中不断分离，致使蛋白表达不稳定，无规律，反映到蛋白电泳图谱上，谱带多、乱、杂，难以鉴定。还需进一步探讨用其他方法(如DNA指纹技术等)进行上述不能鉴别品种的鉴定工作。

转自：《中国种业》